机会很快就来了，因为查理五世解除了和玛丽公主的婚约，转而迎娶了葡萄牙的伊莎贝拉的行为，让亨利八世和大为恼火。
亨利八世开始怨怪凯瑟琳王后和她的娘家，认为是因为凯瑟琳才会让他颜面尽失。
加上凯瑟琳王后迟迟没有生出男性继承人，安妮的野心开始膨胀。
安妮得到了新教派的支持，因为天主教会的腐败，在英格兰国内已经民怨四起，而安妮则承诺，如果支持她成为新王后，那么她将会让新教取代天主教成为英格兰国教。
安妮开始怂恿亨利八世离婚。
由于对安妮的迷恋和对男性继承人的渴望，亨利八世于1527年与大臣向梵蒂冈递交了他与凯瑟琳王后的婚姻无效申请。
亨利八世此举惊叹欧洲，人们不愿意相信亨利八世会放弃凯瑟琳王后身后强大的娘家支持，但亨利八世却安妮的迷恋和对男性继承人的渴望，让他坚持那么做。他相信年轻貌美的安妮一定能替他生个儿子。
1527年5月18日，主教托马斯·沃尔西在威斯敏斯特召开教廷会议审议亨利八世婚姻的合法性，此时罗马教廷的教皇克莱门特七世被神圣罗马帝国皇帝查理五世控制，查理五世反对离婚，5月31日，沃尔西被迫休庭。
在离婚案件审理期间，安妮·博林与沃尔西有所往来，他们共同促进亨利八世与凯瑟琳的离婚事宜，但沃尔西的目的是让亨利八世与法兰西的勒妮结合，教皇被查理五世监禁后，沃尔西奉命前往法国解救，并且在那里召集一次枢机主教大会从而推进离婚程序。
1528年，红衣主教坎佩乔抵达英国参加亨利八世的离婚案件审核，但听证会直到次年1月仍未举行，安妮·博林怀疑沃尔西背叛，所以教会故意拖延离婚程序。之后安妮·博林送给侍女·盖恩斯福特的禁书《基督教徒的顺从及基督教执政者如何治理国家》被发现，安妮·博林在沃尔西告密前向亨利八世献上了此书，亨利八世满意于书中所述君王权利大于教会的表述。
1529年5月，亨利八世与凯瑟琳的离婚审判于黑衣修道院开始，安妮·博林被送回赫弗城堡，这次的离婚审判沃尔西依旧没能帮助亨利八世胜诉，11月，沃尔西被剥夺公民身份和财产权，并于次年死去。沃尔西死后，克伦威尔被招进王宫并于次年升任枢密会重要成员，安妮·博林则搬进了沃尔西在约克广场的旧居，神学家们被纷纷说服同意离婚案。
1530年，查尔斯·布兰登（charles brandon）国王的妹夫叛逃并宣扬安妮·博林与托马斯·怀亚特之间有私情，他的话语此时并未对安妮·博林产生影响，安妮·博林在随后也驳回了他的指控。
1532年9月，亨利八世封安妮·博林为彭布罗克女侯爵，两个月后，他们在加来秘密举行了婚礼，次年1月25日在伦敦再次举行婚礼。5月23日，新任坎特伯雷大主教托马斯·克兰默（thomas clamor）宣布亨利八世与凯瑟琳的婚姻无效，并在5天后宣布亨利八世与安妮·博林的婚姻有效，6月1日，安妮·博林正式加冕为王后并于9月7日诞下女儿伊丽莎白一世，伊丽莎白一世出生不久后就被送往赫特福德郡，之后安妮·博林常去探望她。
除此之外，安妮·博林曾在1534年请求玛丽一世看望伊丽莎白一世，并承认她的王后身份，并说这是玛丽与亨利八世缓和关系的手段，而玛丽将会得到比之前更好的待遇。
安妮·博林的王后排场比前任王后凯瑟琳还大。她有超过250个仆人专职伺候，60个贵族侍女陪伴她。安妮添购许多奢华的礼服、珠宝首饰、羽毛扇、马车、家具等，也重新装潢了几个宫殿以符合她的品味。
安妮·博林聪明果决，自信强势，对政治敏锐热衷，颇有手腕，堪称是亨利八世最完美的情人；然而当安妮成为亨利的妻子后，却变得多疑残忍，刁钻刻薄。后来亨利也对频频干政并且试图推动宗教改革朝更加激进的方向发展的安妮感到厌倦，认为她言辞尖锐、个性泼辣、野心勃勃，并不适合担任一国之母。
1534年4月，安妮·博林再次怀孕，但在三个月后不幸流产，这次流产被亨利八世认为是不洁的分娩行为，因此她被关了起来，早在安妮·博林第一次怀孕的最后几个月，亨利八世就有了其他情人，流产后安妮·博林与亨利八世的感情开始破裂。
一个月后，安妮·博林收到了法国考虑与前任王后凯瑟琳的女儿玛丽一世联姻的消息，这表示法国不承认伊丽莎白一世继承人的身份，安妮·博林因此不满。为了使伊丽莎白一世获得合理继承权，亨利八世于1534年颁布了《继承权法案》，剥夺了玛丽一世的王位继承权，改为安妮·博林所生子女拥有合法继承权。
尽管安妮·博林的身体已经有所好转，但她依旧无法独自处理亨利八世的情人，于是安妮·博林寻求哥哥的妻子简·罗奇福德（Jane Rochford）的帮助，但不久后简就被亨利八世送出宫廷，并宣称简参与了一项阴谋，这使得安妮·博林的声望受到影响。
比起失去亨利八世的爱意，安妮·博林更在意亨利八世是否会重新成为天主教徒，为了防止宗教改革夭折，安妮·博林选择让同为新教信徒的堂妹玛格丽特·谢尔顿（ margaret Shelton）成为亨利八世的情人。
1535年，简·罗奇福德和安妮·博林的姑妈威廉·霍华德（william howard）发表公开声明，表明支持正统天主教君主制代表人物玛丽一世的立场，简更是冲进了格林威治的中心，这份声明成为了玛丽游行示威的一部分，引发了骚乱，简和霍华德被关入伦敦塔，此事不可避免的影响到了作为英格兰王后的安妮·博林以及她在之后宗教改革中的话语权。
1535年秋天，安妮·博林再次怀孕，这一喜讯在圣诞节的时候被公开，同时亨利八世将安妮·博林的表妹简·西摩（Jane Seymour）作为新的情人人选，但简·西摩是虔诚的天主教教徒让安妮·博林不免担忧。
1536年1月，前任王后凯瑟琳在金博尔顿去世，同天，安妮·博林再次流产，期间有天主教徒散布谣言说这是乱伦的产物，安妮·博林与亨利八世的感情宣告破裂。
1536年1月，前任王后凯瑟琳去世后，亨利八世与查理五世之间有了缓和矛盾的机会，克伦威尔认为安妮·博林的存在使得当初英格兰王室与教皇克雷芒七世决裂，并且安妮·博林致力于宗教改革的行为激怒了天主教徒，为避免内部分裂，必须牺牲安妮·博林。
1536年4月24日，亨利八世在克伦威尔递上的委任状上署名，授权大法官查尔斯·布兰登以及数名贵族对犯下叛国罪的人进行全名盘查。
6天后，克伦威尔接到汇报称安妮·博林与马克·斯米顿存在不正当关系，随后马克·斯米顿被逮捕，在审讯过程中他承认与安妮·博林有私情，并供出其他与安妮·博林有私情的人，分别是弗朗西斯·韦斯顿、亨利·诺雷斯和威廉·布里尔顿，之后安妮·博林的弟弟乔治·博林也被加入通奸名单，随后安妮·博林被指控通奸叛国，但她此时的身体状况很差，指控内容并非事实。
在严刑拷打下，最后所有人都承认，安妮王后有不忠的行为。1536年5月2日，安妮由驳船带到伦敦塔，轻度精神崩溃。5月14日，克兰默宣布安妮与亨利的婚姻无效。5月15日，在伦敦塔里，安妮被指控通奸、乱伦和叛国罪，即使安妮敏锐的头脑和伶牙俐齿帮助她多次有力地反驳了对自己的指控，却改变不了最后的判决。5月17日，乔治·博林等被控告的几名男子被处决。
5月19日，上午9点刚过，历史上最富盛名的女人之一，迎来了她悲惨的结局。安妮是因为通奸、乱伦、叛国、制造假币、精神疾病、企图毒死凯瑟琳王后和玛丽公主等18项罪名，被判决斩首。亨利八世从法国请来一位有名的刽子手，让他用一柄极其锋利的长剑，以一种相对优雅的手段，砍下了安妮的脑袋，被斩下的首级甚至还公开展示了一段时间。之后安妮被草草埋葬，才两岁八个月的伊丽莎白成为私生女，被赶出王宫。
国会没有通过让安妮以合适的棺材埋葬，安妮的头与身体被放入一个柜子，埋在伦敦塔的教堂中。安妮的冤情即使在她的女儿伊丽莎白时代也从未被平反，甚至连一块墓碑也没有，直到在维多利亚女王时代翻修时，才被发现确认，覆上一个大理石墓碑。
安妮被处死后第二天，亨利八世随即与安妮生前的侍从女官珍·西摩订婚。十天后正式举行婚礼，珍·西摩成为新王后（珍又称简，来自西摩家族，天主教信仰）。